Laporan
Praktikum Biokimia
I. Tujuan
a.
Dapat mengetahui dan memahami tehnik pemisahan dengan metode
kromatografi lapis tipis.
b.
Dapat menentukan Rf Komponen-komponen yang dipisahkan dan
mengidentifikasi zat yang dipisahkan.
.
II. Dasar
Teori
Kromatografi
adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang dipisahkan
didistribusikan antara 2 fase,salah satunya yang merupakan fase diam
(Stationer Phase),dan yang lainnya ialah fase gerak (Mobile Phase).
Berdasarkan
terikatnya suatu komponen pada fase gerak,komponen-komponen suatu
campuran dapat dipisahkan.komponen yang kurang larut dalam fase gerak
atau yang lebih kuat terserap atau terabsorbsi pada fase diam akan
tertinggal,sedangkan komponen yang lebih larut atau kurang terserap
akan bergerak lebih cepat.
Pada
percobaan kali ini yang akan kita bahas adalah Kromatografi Lapis
tipis (KLT).
Kromatografi
lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik pemisahan yang sederhana dan
banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran
plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering bentuk
silika gel, alomina, selulosa dan polianida. Untuk menotolkan larutan
cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa
kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan
pengulsi di dalam wadah yang tertutup. (Chamber)
Kromatografi
Lapis Tipis (KLT) ini mirip dengan kromatograafi kertas, hanya
bedanya kertas digantikan dengan lembaran kaca tau plastik yang
dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti alumina, silike gel,
selulosa atau materi lainnya.
Lapisan
tipis adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam.
Kromatografi lapis tipis lebih bersifat reproduksibel ( bersifat
boleh diulang) dari pada kromatografi kertas.
Sebagai
fasa diam dalam KLT berupa serbuk halus dengan ukuran 5 – 50
mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar ion. Bahan
adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk
selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidrosil
dipermukaannya yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan molekul –
molekul pokar.
Untuk
membuat lapisan tipis pada KLT perlu dibuat bubur (slurry) ber air
dari serbuk halus tadi. Zat pengikat dapat menggunakan gips, barium
sulfat, polivenil alcohol atau kanji perlu ditambahkan, untuk
membantu peletakan lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus ini
kemudian ditebarkan pada papan penyangga (kaca, plastik atau
aluminium), secara merata sehingga diperoleh ketebalan lapisan 0,1 –
0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan dengan pengeringan didalam
oven pada suhu 100 oC selama beberapa jam.
(http://robbaniryo.com/ilmu-kimia/kromatografi-lapis-tipis-klt/)
Pemisahan campuran
dengan cara kromatografi didasarkan pada perbedaan kecepatan merambat
antara partikel-partikel zat yang bercampur pada medium tertentu.
Dalam kehidupan sehari-hari pemisahan secara kromatografi dapat kita
temui pada rembesan air pada dinding yang menghasilkan garis-garis
dengan jarak ternentu.
III. Alat Dan Bahan
1.
Lempeng KLT
2.
Bejana KLT
3.
Kaca arloji
4.
Etanol
5.
Mikro pipet
6.
Mistar
7.
Pensil
8.
Tissue
9.
Zat warna tunggal I (Rodamin)
10. Zat warna tunggal II (Yellow)
IV. Cara Kerja
Jernihkan terlwebih
dahulu bejana KLT dengan cara mengolesi bagian atas bejana dengan Vaselin dan
ditutup ± 15 menit.
Totolkan masing-masing
5ml zat warna tunggal I , zat warna tunggal II , dan campuran zat warna I &
II pada titik awal penotolan dengan diberi jarak ± 1cm
Eluasi menggunakan fase
erak sampai batas akhir eluasi
Hitung
Rf
V. Data
Hasil Pengamatan (Perhitungan)
Rf merah (zat tunggal
I) 
= 0,89
terbawa oleh eluen (larut oleh eluen)
Rf biru (zat tunggal II) 
Rf Campuran 
= 0,91
terbawa oleh eluen (larut oleh eluen)
Keterangan:
Rf yang baik antara 0,3 – 0,7
VI. Pembahasan
Analisis
kuantitatif dengan KLT ada dua macam. Yang pertama noda cuplikan setelah
dikembangkan diukur langsung luasnya atau kerapatannya (density). Secara manual
atau menggunakan alat – alat yang disebut densitometer. Tehnik ini disebut
evaluasi ’“in one”. Luas atau kerapatan noda dibandingkan dengan kerapatan noda
senyawa standar yang telah diketahui konsentrasinya. Cara yang kedua, noda
diambil dengan cara dikerok atau diisap dengan suatu alat kemudian dilarutkan
dalam suatu pelarut dan larutan terakhir diamati dengan spectrometer UV – vis
atau ditimbang (gravimetric) setelah pelarut diuapkan. Cara gravimetric hanya
dapat dilakukan apabila jumlah cuplikan cukup besar. Cara ini tidak membutuhkan
standar pembanding
Pada percobaan ini, tehnik kromatografi
lapis tipis yang digunakan adalah suatu plat tipis (aluminium) yang
berfungsinya untuk tempat berjalannya adsorbens sehingga proses migrasi analit
oleh solventnya bisa berjalan. Hal ini Inilah yang membedakan antara
kromatografi kertas dengan kromatografi lapis tipis. Yang dimana pada KLT
menggunakan plat tipis sedangkan pada KK menggunakan kertas (lapisan selulosa)
sehingga proses elusinya lebih lama (kira – kira 10 – 20 menit lebih lama dari
KLT). Perbedaan lainnya dari kedua kromatografi tersebut adalah pembentukan
noda pada adsorbensnya dimana pada KLT noda yang dihasilkan lebih tajam
dibandingkan noda yang nampak dalam KK. Hal ini disebabkan pada KK penyusun
dari adsorbens berupa selulosa yang dapat mengikat air, sehingga ketika dielusi
dengan suatu pelarut atau fase gerak maka noda yang dihasilkan mengalami
penyebaran akibat terdapatnya gugus –OH dalam adsorbens yang masih tertingal
dalam fase diamnya sehingga penampakan nodanya terlihat lebih pudar dan bentuk
nodanya tidak bulat. Sedangkan dalam KLT adsorbens yang digunakan berupa slika
gel (SiO2) yang tidak mengikat molekul air, sehingga noda yang tercipta lebih
terfokus dan tajam.
Pada percobaan ini, didapatkan nilai
Rf yang berbeda-beda dari tiap analit. Pada penentuan nilai Rf pada zat tunggal
I & zat tunggal II secara berturut-turut adalah 0,89 , 0,625 dan Rf pada
zat warna campuran adalah 0,91 & 0,625
VII. Kesimpulan
Berdasarkan
hasil pengamatan dan pembahasan dari percobaan diatas, maka dapat disimpulkan
sebagai berikut yakni Tehnik pemisahan dengan kromatografi lapis tipis
merupakan tehnik pemisahan kromatografi planar dimana zat – zat dipisahkan
berdasarkan perbedaan migrasi solute/ zat terlarut antara dua fase (fase gerak
dan fase diamnya). Dimana fase diamnya/ adsorbensnya dilapisi dengan plat tipis
(aluminium) sebagai penunjang adsorbennya dan nilai Rf yang didapatkan adalah
nilai Rf pada zat tunggal I & zat
tunggal II secara berturut-turut adalah 0,89 , 0,625 dan Rf pada zat warna
campuran adalah 0,91 & 0,625
VIII.
Daftar
Pustaka
-
Rudi,L.
2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Universitas Haluoleo. Kendari
-
Buku Petunjuk Praktikum Biokimia,
Fakultas Farmasi UKWMS, 2011
Surabaya,
29 September 2011
Praktikan,
(Melia
Ivana Wijaya)